酶联免疫吸附试验( enzyme-linked immunosor-bent-assay，ELISA) 因其敏感度高、特异性强、操作简单、重复性好而且不需要昂贵的仪器而得到广泛使用，但ELISA 测定中影响因素很多，而且操作中有一定的技术要求，在临床检验中如果处理不当，会出现一些错误结果( 假阳性和假阴性) 。现就ELISA 实验中经常碰到的异常结果予以分析，供大家参考。

1 异常结果分析

1． 1 白板显色步骤结束后，酶标板所有孔均无颜色。可能是试剂已过有效期或不同试剂盒组分混用，错加、漏加试剂组分，洗板及加样过程中，酶标受污染失活而失去催化显色剂显色的能力所致。

1． 2 显色弱、灵敏度低

1． 2． 1 未按说明书要求操作实验结束后，包括阳性对照、质控在内的所有板孔颜色均较淡。原因是:①超过有效期的产品可能会产生很弱的信号。②试剂、样品在使用前未平衡至室温。③加入试剂的体积和时间( 顺序) 有误。④洗板和加样过程中，酶标受污染失活催化显色剂显色的能力所致，或显色液受污染。⑤孵育时间及孵育温度未达到要求。⑥洗板次数过多，或浓缩洗液稀释倍数不符合要求，或用其他厂家洗液洗板，导致灵敏度低。

1． 2． 2 标本含有防腐剂实验结束后，阴性与阳性对照正常，质控正常，但标本显色较弱。原因是:①待测标本中可能不含强阳性标本，故结果可能是正常。②标本加入叠氮钠作为防腐剂。

1． 2． 3 标本或质控品保存、孵育不当实验结束后，阴性与阳性对照正常，但质控、个别弱阳性标本没能检出。原因是: ①未达到要求的孵育温度及孵育时间可检出强阳性标本，但质控或弱阳性标本受温度变化影响较大而未被检出。②质控品或标本高温放置过久被反复冻融，以致待测物滴度下降，而未被检出。③仪器设定不正确，或滤光片不匹配。

1． 2． 4 酶标仪参数不对实验终止后，目测结果正常，但酶标仪读数结果偏低。可能是酶标仪设定不正确或滤光片不匹配。

1． 3 灵敏度过高、板底高、高背景

1． 3． 1 花板实验终止后，整板结果呈现均一的黄色或淡黄色，或阴阳性对照、质控正常，阴性标本OD值过高。原因是: ①整板的黄板现象可能是由于错加其他试剂造成。②酶标对吸头的污染以及对盛放显色剂容器的污染都易造成黄板现象。③孵育温度过高或孵育时间过长。④未按要求洗板，用自来水或其他公司洗液洗板，特别是洗液时每孔未注满洗液，易造成花板黄板现象。⑤阴阳性对照、质控正常，阴性标本OD 值过高的情况称为花板，一般是由于标本的收集、处理和保存方法不当，洗板不切底、显色时间延长造成［1］。

1． 3． 2 跳孔出现随机性的花板、跳孔现象。原因是: ①加样时交叉污染。②手工洗板造成的交叉污染。③洗板机某几个加液头堵塞导致花板、跳孔。④拍板时交叉污染。

1． 4 假阳性出现假阳性的原因有: ①计算Cutoff值时使用的公式不正确，导致计算得出的Cutoff 值过低，从而导致出现假阳性。②洗板时板孔未能注满洗液，或洗板次数、浸泡时间不够，用其他公司洗液洗板，导致花板、跳孔以致假阳性增多。③血清标本处理不当，如标本严重溶血、脂血［2，3］，未除去细胞成分、纤维蛋白原、胆红素、血红蛋白及血液黏度过大等，可出现孔底由点变蓝的跳孔现象，此标本重复实验结果往往是阴性。④厂家试剂质量的变化造成。

2 对策

2． 1 检查试剂实验前检查试剂的组分和批号，确认试剂未过期，以及确认所有组分均属于对应的试剂盒。不同试剂盒或不同批号的试剂不能混用。严格按说明书的步骤操作，错加、漏加试剂组分将会出现白板的异常结果。加完试剂后可观察一下液面高度是否一致，以减少漏加现象。叠氮钠等酶抑制物会使HRP 酶标失活，应确认盛酶标的容器不含酶抑制物［4］，确认配制洗液的容器已洗干净，确认配制洗液的纯化水达到要求且未受污染。

2． 2 试剂平衡从低温冰箱中取出的试剂，打开试剂盒，取出各组分，在室温平衡30 min 以上，才能开启各组分包装，开始使用。试剂的平衡方式、时间和效果，将直接影响试剂对弱阳性标本的检出能力。确定所使用的每个试剂体积正确，加入时间适当。孵育时间、孵育温度、洗板次数和浸泡时间严格按说明书要求去做。

2． 2． 1 防腐剂选择酶联免疫实验中的标本禁用叠氮钠作为防腐剂，可选用Proclin、硫柳汞等其他防腐剂，如怀疑实验有问题，可复检。

2． 2． 2 质控品或标本要求质控品从冰箱中取出时要室温平衡30 min 以上，使用前反复摇匀，不要剧烈振荡。确认孵育的温度及孵育时间是否达到要求。质控品或标本避免反复冻融，标本的反复冻融所产生的机械剪切力将对标本中的蛋白分子产生破坏作用，从而引起假阴性结果。如标本在保存过程中出现细菌污染所致的混浊或絮状物时，应离心沉淀后取上清液检查。质控品使用1 周就要更换，避免细菌污染对结果产生影响。一旦发现结果偏高或偏低，马上查找原因，如有必要及时更换新的质控品。选用临界值血清做室内质控可防止因弱阳性引发的标本漏检［5］。为减少质控品批号变换造成的影响，适当增大同一批号的试剂和质控品的库存量( 4～ 5个月为宜) ［6］。标本在1 周内使用的可储存在2～ 8℃冰箱里，如需长期保存，应置于－ 20℃以下保存，质控品应小量分装，并置－ 20℃以下保存。重新设定酶标仪的参数。

2． 2． 3 检查滤光片是否匹配设备老化( 酶标仪的光源、光电转换器的老化衰退等) 是影响结果的一个重要原因。酶标仪不应安置在阳光或强光照射下，使用前先预热仪器15～ 30 min，测读结果更稳定。比色前根据实验项目的不同选择不同波长的滤光片，现在酶联免疫吸附试验一般采用双波长( 450 nm/630 nm) 的滤光片来比色，双波长比色测定具有能排除有微滴板本身、板孔内标本的非特异吸收、指纹、刮痕、灰尘等对特异显色测定吸光度的影响的特点。不按说明书要求选择滤光片会得出错误的结果。在使用双波长进行结果判读时，不应再设空白对照，以免出现假阴性结果［7］。

2． 3 灵敏度过高、板底高、高背景解决办法

2． 3． 1 严格操作实验前检查试剂的组分和批号，确认试剂未过期，以及确认所有组分均属于对应的试剂盒。不同试剂盒或不同批号的试剂不能混用。避免试剂组分间的交叉污染，确保吸头、容器的干净。显示剂使用前避光保存，孵育时间、孵育温度、洗板次数和浸泡时间严格按说明书要求去做。

2． 3． 2 洗板注意事项加标本时尽量避免交叉污染，如盛标本的试管周围有血痂，易脱落，应远离酶标板。手工洗板时前3 次注满洗液后立即弃去，后几次再设定浸泡时间，可减少交叉污染。疏通洗板机加液头，使洗板时每孔均注满洗液。洗板完后拍板时应用合适的吸水纸巾，应注意不要把无关物质拍进板孔，并尽量不要在同位置拍，以免交叉污染。

2． 4 试剂灵敏度高质量的标本前处理，是保证血液ELISA 自动化检验质量的重要前提［8］。拒收溶血、受细菌污染的不合格样品，否则细菌和红细胞中过氧化酶的作用可使结果出现假阳性［9］。脂浊对ELISA 的影响主要考虑脂浊造成血清黏度大，分子运动速度减慢，减少抗原抗体结合的概率或由于乳糜微粒产生的屏蔽效应而对测定结果产生负干扰［10］。标本用3000 r /min 离心15 min，完全分离血清后再作实验［11］。Cutoff 值计算公式应严格参照说明书，每种试剂的Cutoff 值计算公式不尽相同。调整洗板机时，应注意仪器标示的液量与实际液量并不相符，应根据实践情况调整注满每孔。当国家标准要求提高灵敏度时，厂家试剂的灵敏度也相应提高，假阳性也有所上升，但只要在合理范围，是可以接受的。ELISA 检测影响因素很多，上述只是一些常见因素分析，要想提高ELISA 检测的检测质量，关键还要加强实验室科学管理，强化标准化流程操作，加强质量控制，提高人员素质，减少检测假阳性、假阴性结果的发生。

参考文献

［1］ 张生吉． ELISA 试验“花板现象探讨”［J］． 中国现代实用医学，2008，5( 7) : 63-64．

［2］ 孙家志． HIV 实验室检测质量管理的探讨［J］． 中国卫生质量管理， 2008，15( 4) : 69-70．

［3］ 许斌． ELISA 检测HBsAg 影响因素的探讨［J］． 临床检验杂志，2007，18( 4) : 232．

［4］ 刘永鹏，连丽珍． HIV 初筛试验中外源性物质影响的探讨［J］．中国社区医师， 2007，11( 9) : 116．

［5］ 杨红梅，魏胜男． 应用“双质控法”加强和完善“即刻法”室内质控的探讨［J］． 中国输血杂志，2009，22( 11) : 917-918．

［6］ 李健，卢春柳，孙泽峰． 广西采供血机构实验室2008 年室内质控情况的调查分析［J］． 中国输血杂志，2009，22( 9) : 743-744．

［7］ 李丽平． 空白值对MK3 半自动酶标仪使用双波长测定结果的影响［J］． 中国输血杂志，2010，23( 8) : 629-630．

［8］ 张开慧． 确保ELISA 自动化检验的质量需注意的几个要点［J］． 中国输血杂志，2008，21( 6) : 452-453．

［9］ 邓文青，吴湘云，代建平，等． 220 份HIV 抗体检测确证为阴性或不确定标本的结果分析［J］． 中国艾滋病性病， 2011， 17( 1) : 22-24．

［10］ 张桂芳． 双抗原夹心法检测HIV 抗体影响因素研究［J］． 现代检验医学，2010，25( 3) : 115-116．

［11］ 中国疾病预防控制中心． 全国艾滋病检测技术规范［Z］． 2004．

注明：本文摘自陈成进在《医学综述》发表的文章，如有侵权，请联系我们。