1. 什么是批间变异性

批间变异性lot-to-lot variance（LTLV）也称作batch Variability,可能由多种因素引起，包括关键试剂的质量、稳定性和制造工艺的变化，以及原材料的储存和处理条件等[2-4]。LTLV 对免疫测定的准确度、精密度和整体性能有重大影响，这可能导致结果不一致和不准确[5]。

２．　为什么会出现LTLV？

在技术层面，免疫测定的质量由两个关键要素决定：原材料和生产工艺。据估计，免疫测定的 70% 的性能归因于原材料，而其余 30% 归因于生产过程（如缓冲液配方、试剂配方等）。生产工艺保证了试剂盒质量和重复性的下限，而原材料则为 IVD 试剂盒的灵敏度和特异性提供了基础，从而形成了试剂盒质量的上限，犹如锦上添花。为了查明 LTLV 的原因和起源，有必要详细探讨这两个方面。此外，分析物表位的不稳定性在某种程度上也会导致 LTLV。

３.　如何最大限度得减少LTLV？

3.1 抗原设计

抗原设计是开发临床应用可靠免疫测定的关键环节。为减少潜在问题，应避免选择已知含糖基化位点的表位。但如果某个糖基化表位具有重要临床意义，也可合成或表达糖基化抗原用于抗体制备。表位中应避免包含脯氨酸 - 赖氨酸、甲硫氨酸 - 缬氨酸、甘氨酸 - 半胱氨酸、精氨酸 - 异亮氨酸、亮氨酸 - 精氨酸、精氨酸 - 精氨酸或赖氨酸 - 甲硫氨酸等氨基酸序列，因为这些序列可能被血液中的多种蛋白酶切割。不过，有一种例外情况：表位中的糖基化残基可通过阻断酶对糖基化切割位点的接触，从而抑制蛋白酶的加工作用 [25]。此外，在选择抗原表位时，若上述氨基酸序列位于表位上下游 10-30 个氨基酸范围内，也需谨慎处理 —— 因为这些位点的潜在切割可能消除空间阻碍，导致临床样本中分析物水平随时间升高，进而干扰抗体与抗原的相互作用。

3.2 抗原和抗体的关键质量属性

受现有诊断技术限制，通过生产过程优化来降低免疫测定批间差异的空间有限，因此原材料的质量至关重要。抗原和抗体是决定免疫测定性能的核心成分，二者各有独特的特异性、亲和力、表面电荷和溶解度等属性。为确保抗原和抗体批次间的一致性，需进行全面的质量控制分析，包括监测浓度、免疫反应性、电荷同工型分布、纯度和均一性等。关键质量属性（如等电点、电荷分布、免疫球蛋白类别和亚类、稳定性及动力学常数）必须在各批次间保持一致。若这些属性失控，可能导致一系列问题，例如每批新体外诊断试剂盒都需重新优化抗原 / 抗体用量、出现灵敏度问题、需重新优化标记 / 包被过程的 pH 或体积，以及需要去除聚集物、片段或杂质等。

3.2.1 减少抗原和抗体的聚集

为减少蛋白质聚集，建议将抗体储备液保持在较低浓度，因为高蛋白质浓度易导致聚集。但低浓度可能导致蛋白质在容器表面吸附损失。在某些情况下，为满足偶联需求（如 HRP 标记），较高的蛋白质浓度是必要的。因此，理想的做法是在储存缓冲液中添加稳定剂以减少聚集。根据作用机制，可向缓冲液中添加两类主要稳定剂： kosmotropes（促序剂）和 chaotropes（离液剂）。促序剂（如蔗糖、甘油、甘氨酸、精氨酸 [9,29] 和山梨糖醇 [30]）通过稳定蛋白质周围的水化层来维持蛋白质的天然结构（图 4a）。离液剂（如盐酸胍和尿素 [9]）通过干扰并削弱蛋白质周围的水化层，减少或阻碍蛋白质间的相互作用（图 4b）[31]。聚乙二醇（PEG）或非离子去污剂等大分子添加剂可直接遮蔽蛋白质上的疏水位点，从而阻止这些位点与邻近蛋白质的疏水位点发生相互作用 [32]。其他常用添加剂包括精氨酸和柠檬酸盐。表 3 总结了常用于减少蛋白质聚集的添加剂及其建议浓度范围。由于不同添加剂的作用机制不同，建议尝试多种添加剂以确定效果最佳者。尺寸排阻色谱 - 高效液相色谱（SEC-HPLC）可用于去除大量蛋白质聚集物。

3.2.2 定期监测抗原和抗体的等电点

蛋白质电荷分布的异质性可能导致蛋白质聚集，进而降低免疫测定的灵敏度。这种现象在等电点（pI）时尤为明显 —— 此时蛋白质不带净电荷，相互排斥作用减弱，可能导致沉淀。毛细管等电聚焦（cIEF）是一种用于生成电荷同工型图谱的分析技术，该图谱是抗原和抗体独特的 “指纹”。表征这些关键成分的等电点和电荷同工型图谱，对于在测定开发过程中选择合适的缓冲液 [33]，以及维持试剂的稳定性和一致性至关重要。为此，建议确定至少 10 个批次的每种抗原和抗体的等电点范围，验收标准包括新批次的 IEF 图谱与参考图谱的相似性，以及在从 10 个批次中确定的特定等电点范围内。

3.2.3 抗原和抗体的准确定量

蛋白质定量方法多样，如紫外分光光度法（UV 280）、福林 - 酚法（Lowry 法）、二辛可宁酸法（BCA）和布拉德福德法 [34] 等。这些方法原理不同，各有优缺点。UV280 法通过基于氨基酸序列计算摩尔消光系数来进行蛋白质定量 [35]，但容易受到微量核酸等紫外吸收杂质的干扰，导致蛋白质浓度测定不准确 [36]。为确保蛋白质定量准确，建议对每批抗原、酶、抗体和结合物采用多种方法（如 UV280 和 BCA 法）进行定量。此外，有必要为每种蛋白质建立单独的定量校准品，这可避免单一方法引起的蛋白质定量误差，确保同一产品不同批次间的一致性，从而使最终免疫测定的批次差异最小化且配方一致。

3.2.4 抗原和抗体的纯度测定

毛细管电泳 - 十二烷基硫酸钠（CE-SDS）是测定抗原和抗体纯度的推荐方法，而比活性是评估酶相对纯度的有用指标。此外，质谱（MS）和高效液相色谱（HPLC）有助于检测污染蛋白、样品蛋白水解和微小截断 [34]。可采用两种不同方法确认样品的同一性：“自上而下” 质谱法通过检测完整蛋白质的质量来识别纯化过程中的任何降解；“自下而上” 质谱法则通过质谱指纹图谱或胰蛋白酶消化来确认所使用的是正确的蛋白质，从而避免潜在错误（例如误用了意外纯化出的、分子量相近的宿主蛋白）[7]。

3.2.5 抗原和抗体的均一性测定

为确保试剂质量，评估其均一性至关重要。均一性指抗原和抗体的尺寸分布，与聚集物的存在密切相关。虽然多分散性不一定意味着不稳定性，但制剂中若检测到大量聚集物，则表明蛋白质可能未处于最佳功能状态。这可能导致实验结果错误，例如在抗原 - 抗体相互作用研究中高估活性蛋白的浓度 [7]。可采用多种分析技术检测均一性，包括尺寸排阻色谱 - 高效液相色谱（SEC-HPLC）、尺寸排阻色谱 - 多角度光散射（SEC-MALS）和动态光散射（DLS）[34]。其中，SEC-HPLC 是表征蛋白质样品最常用的系统，可有效分离和检测抗体的聚集物、片段和未配对链。通过测定单体相对于其他形式的相对丰度，该技术可提供有关蛋白质样品组成的有价值信息。高均一性表明试剂稳定性良好，建议合格的抗原和抗体中单体含量至少占 95%。

3.2.6 最大化抗原和抗体的储存稳定性

在蛋白质科学中，稳定性指蛋白质在特定储存条件下在规定时间内维持其功能的能力。蛋白质的稳定性与批次一致性直接相关，且有助于减少变异性。大多数抗原和抗体的标准储存溶剂是中性 PBS 缓冲液。然而，由于蛋白质的性质和等电点不同，它们可能通过多种途径发生降解，包括聚合、变性、失活以及与包装材料的相互作用 [37]。因此，有必要为每种抗原和抗体制定独特的储存缓冲液以确保最佳稳定性。为此，我们实验室在 11 种不同缓冲液中评估了两种杂交瘤抗体（PRO-C3 [38]、PRO-C6 [39]）和一种重组抗体（CTX-III [14]）的应激稳定性。值得注意的是，在 37°C 应激处理 14 天后，常规 pH 7.4 的 PBS 缓冲液并未为任何测试蛋白质提供最佳稳定性（图 5）。

3.2.7 抗原和抗体的定向偶联

抗原和抗体常与各种分子在随机位点以随机取向发生偶联，这可能影响它们的免疫反应性，并在最终的体外诊断（IVD）试剂盒中引入相当大的批间差异（LTLV）。然而，将小分子药物偶联至抗体上特定糖基化位点的方法日益普及，这种方法可生成相对均一的抗体 - 药物偶联物制剂，且各批次的标记比例和位点等理化性质一致 [40,41]。这些定向偶联方法也可用于抗原和抗体，以减少关键试剂的批间差异 [42,43]。

3.3 试剂盒质控品和质控盘

为减少免疫测定中的批间差异（LTLV），可采取多种措施，如向质控盘中添加蛋白酶抑制剂和防腐剂，或对整个盘进行冻干处理。据报道，抑肽酶 [25]、苯甲脒和 4 - 苯磺酰氟盐酸盐（AEBSF）[44] 是保护脑钠肽（BNP）在样品储存过程中免受降解的有效蛋白酶抑制剂。使用与试剂盒校准品采用不同材料和工艺制备的定制对照品，可有效监测测定完整性和批间差异。第三方对照品的优势在于其与测定试剂的生产相互独立，能为质量控制提供额外保障。对照品应足够灵敏，以检测由试剂或试剂盒批次变化引起的偏差，从而在报告错误的患者结果之前采取纠正措施。

3.4 缓冲液和溶液制备参数的一致性

为确保免疫测定的重现性，不同批次制备时必须保持搅拌速度、时间和温度的一致性。由于某些缓冲液的粘度和 pH 值会随温度变化，建议所有批次采用相同的制备条件。应对温度、电导率、280nm 吸光度（OD280）、pH 值以及渗透压（对于基于血清的试剂盒质控品和校准品）等理化参数进行过程中测试，以确保缓冲液混合充分。应避免过度混合，以防对抗原和抗体溶液造成机械剪切损伤。为制定可接受的规格标准，建议记录至少三个批次的理化参数，并以其平均值作为参考。

Lot-to-Lot Variance in Immunoassays—Causes, Consequences,and Solutions

Yunyun Luo, Diagnostics 2023

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